一、引言

在免疫组化（IHC）等生物医学实验中，抗原修复是必不可少的一环。

随着组织固定技术的进步，常用的固定剂（如福尔马林）能够有效保护样本的结构完整性并显著提高切片保存时间。

然而，这些固定剂不可避免地导致抗原决定簇的掩蔽效应，使抗体识别位点隐藏大大影响实验的灵敏度和特异性。

为最大化信号检测强度和实验数据的可信性，我们将集中讨论抗原修复的重要性。

二、抗原修复的基本原理

1.为什么需要抗原修复？

在组织样本的制备过程中，固定剂的使用是必须的，其作用是将组织中的生物分子“固定”在原位以防止降解和扩散。

然而，这一过程中，化学交联可能掩蔽抗原决定簇，使抗体难以结合，称为抗原“掩蔽”。

这种掩蔽会显著降低免疫染色的效能，导致信号强度低或产生非特异性结合，影响实验准确性。

2.基本概念介绍

抗原修复是为了解决上述问题而发展出来的一项技术。

其理论基础在于，修复过程能够解除固定剂所导致的交联或掩蔽，从而暴露抗原位点。

通过对样本施加热或酶作用，修复方法可以破除化学键，恢复抗原空间构象，提升抗体结合效率。

这一过程直接影响到免疫组化实验的成败，是实现敏感性和特异性结果的关键步骤。

三、抗原修复的方法概述

1. 热诱导抗原修复（HIER）

步骤概述：

样本准备：将已经固定并包埋的组织切片（4 µm）置于载玻片上，并在60℃放置过夜以去除多余的包埋剂。

脱蜡与再水化：在干燥箱中将切片置于二甲苯中，室温下处理5-10分钟以脱蜡。随后，将切片依次置于100%、95%、70%的乙醇溶液中各处理3分钟，并用流动自来水冲洗1分钟后，再加入蒸馏水中。

修复介质准备：配制0.01M柠檬酸缓冲液（pH 6.0）或1mM的EDTA缓冲液（pH 8.0），并加热至95-100℃。

修复过程：将载玻片放入已经预热的缓冲液中，确保切片完全浸没。使用微波炉、蒸锅或压力锅处理15-30分钟，以达到最大修复效果。

冷却与后续处理：从加热源取出后，立即将玻片转移到室温下冷却，持续20分钟。接着，用PBS（磷酸盐缓冲盐水）冲洗4分钟，准备进行下一步试剂处理。

2. 酶诱导抗原修复（EIER）

步骤概述：

样本准备：同样需要执行切片脱蜡和再水化步骤，如前述HIER方法。

酶溶液准备：根据抗原类型配制适用的酶溶液，例如：0.1%胰蛋白酶（pH 7.8）或0.5%胃蛋白酶（pH 2.0）。

酶孵育：将切片放置于酶溶液中，在37℃孵育温箱中浸泡15-30分钟。酶的种类、浓度及处理时间可基于样品类型和实验要求进行调整。

中止反应：用PBS缓冲液漂洗切片3次，每次5分钟，以停止酶活性。

后续处理：与HIER类似，用PBS做好清理后，继续其他免疫染色步骤。

3. 对比分析选择建议：

优缺点对比：HIER适用于相对标准化实验，其优点是抗原修复广泛而稳定，而EIER在对特定肌肉及结缔组织上修复效果更佳。

实验选择：将EIER与HIER结合使用可以提供更全面的效果。例如，先行HIER后接短时间EIER作为补充，可能更好地暴露特殊抗原位点。

四、抗原修复的优化策略

参数优化在进行抗原修复时，修复时间、温度和介质浓度是决定效果的重要参数。

时间过长或温度过高可能导致组织结构的损伤，而过短或温度过低又可能不能充分恢复抗原活性。

通常，修复时间可在15到30分钟内调整，具体时间需根据抗原特点和组织类型进行预实验确定。温度则以95℃为常用起始点，逐步调节。

介质浓度同样重要。对于HIER，用于修复的缓冲溶液（如柠檬酸、EDTA）需精准配置，比如0.01M的柠檬酸pH 6.0被广泛应用在许多标准染色程序中。

调整pH值和浓度还需要依据目标蛋白质结构来进行，以达到最佳效果。

五、 实验常见问题和解决背景染色：

修复不当可能导致非特异性染色，增加背景。

解决此问题的方法包括延长封闭时间或调整一抗和二抗的稀释度。

1.组织损伤：在高温或高浓度介质下，组织可能受到破坏。降低温度或选择较缓和的修复条件，如使用较短的修复时间和适当浓度的介质，可以有效防止损伤。抗原丢失：在预实验中需确定适当的修复强度，以避免因过强修复导致的抗原位点流失。

2.经验分享：在实际操作中，配置修复介质时需使用新鲜配置的溶液和高纯度试剂，以确保最大效果。使用逐步优化法（One Variable at a Time），分别调整一个参数并观察其对实验结果的影响。定期校验和调整热处理设备的温度均衡性，以避免局部过热或不足。