一、实验准备
培养皿/板包被处理：
使用Matrix进行培养皿/板的包被处理。Matrix通常保存在-20℃，使用前需放在4℃冰箱或冰上解冻。
按1:100的比例迅速用PBS液体稀释Matrix，并加入培养皿/板中，覆盖整个皿底。
放到37℃培养箱中4小时，使用前去掉包被液。如果暂时不使用，可用封口膜密封，在4℃冰箱保存一周。
培养基准备：
准备iCell解冻完全培养基（包括iCell解冻液基础培养基和iCell解冻液添加剂）。
加入适量的解冻液，并补充10ug/ml的Y27632因子，放入37℃培养箱中预热。
二、细胞复苏
1.细胞解冻：
从液氮罐中取出冻存管，迅速转移到生物安全柜中。
用预热好的完全培养基进行解冻，用移液枪不停地往冻存管中打入和抽出培养基，直至细胞完全溶解。
2.离心与重悬：
200Xg离心5分钟，去掉上清液。
加入1ml的iCell完全解冻培养基（含10ug/ml的Y27632因子），用手指弹碎管内沉淀。
补充适量的iCell完全解冻培养基到离心管中，轻轻吹吸三四次后加入培养皿/板中。
水平十字振动使细胞均匀分布，放入5% CO₂、37℃培养箱中培养24小时。
三、细胞培养与传代
1.培养基更换：
24小时后换成iCell完全培养基。
以后每隔22-24小时换液。
2.细胞传代：
当细胞长满80-90%时，需要进行传代。
传代前进行培养皿/板的包被处理，做法与复苏时相同。
准备37℃预热好的无钙镁离子PBS溶液及传代工作液（0.5mM EDTA+0.025%胰酶）。
吸走iCell完全培养基，加入预热好的PBS溶液清洗二次。
加入适量的传代工作液，37℃放置4-5分钟，显微镜下观察到大部分克隆边缘开始脱离培养皿/板底时，迅速吸去传代液。
加入适量的iCell完全培养基终止消化，用移液器扇形吹打皿/板底部，使附着的细胞集落脱落。
移入离心管，离心后重悬，按1:8-1:12的比例进行传代。
四、细胞冻存
1.冻存液准备：
准备适量的冻存液（90% iCell完全培养基与10% DMSO）。
2.细胞冻存：
将需要冻存的细胞离心后重悬在冻存液中。
按6孔板每孔冻1支，150px皿冻2-4支，250px皿冻6-12支的比例，将细胞悬液转移至冻存管中。
放入程序降温盒中，逐步降温至-80℃，然后转移至液氮罐中长期保存。
五、注意事项
1.无菌操作：整个实验过程需要严格遵守无菌操作规范，以防止细胞污染。
2.温度控制：培养基和试剂需要在使用前进行预热，以避免温度对细胞生长状态造成不利影响。
3.细胞观察：每次换液时要观察细胞生长状况以及细胞形态的变化，并对细胞进行拍照记录。
4.操作轻柔：用移液器吹打细胞时，要轻柔操作，避免对细胞造成损伤。
