一、实验步骤

1. 细胞复苏

准备：将含有 1mL HL-60 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加 4mL 培养基混合均匀。

离心：在 1000rpm 条件下离心 3 分钟，弃去上清液，加 1-2mL 培养基后轻轻吹匀。

培养：将所有 HL-60 细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入 6cm 皿中，加入约 4mL 培养基，培养过夜）。

检查：第二天换液并检查 HL-60 细胞密度。如果 HL-60 细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。

2. 细胞传代

方法一：

收集：收集 HL-60 细胞，1000RPM 条件下离心 3-5 分钟，弃去上清液，补加 1-2ml 培养液后吹匀。

分瓶：将细胞悬液按 1:2 到 1:4 的比例分到新的含 8ml 培养基的新皿中或者瓶中。

方法二：

换液：可选择半数换液方式，弃去半数培养基后，将剩余 HL-60 细胞悬起。

分瓶：将细胞悬液按 1:2 到 1:3 的比例分到新的含 8ml 培养基的新皿中或者瓶中。

3. 细胞冻存

收集：收集 HL-60 细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000rpm 条件下离心 4 分钟，弃去上清液，用 PBS 清洗一遍，弃尽 PBS，然后进行细胞计数。

配制冻存液：根据 HL-60 细胞数量对应加入无血清细胞冻存液，使细胞密度 5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存 1mL 细胞悬液，注意冻存管做好标识。

冻存：将冻存管放入 -80℃冰箱，24 小时后转入液氮罐储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

二、培养技巧

1.培养条件：

形态特征：淋巴母细胞样，悬浮生长。

培养基：80%IMDM+20%FBS+PS。

生长条件：气相 95%空气+5%二氧化碳；温度 37℃。

传代方法：1:2 至 1:4，每周 3 次。

冻存条件：无血清冻存液（或者冷冻保存液：90%血清，10%DMSO，现用现配），液氮储存。

2.操作注意事项：

复苏时尽快离心去除 DMSO：避免 DMSO 刺激 HL-60 细胞发生分化。

维持稳定环境：不频繁拿出培养箱，不频繁离心。

控制传代比例：当培养密度达到 1×10^6/mL 左右时可传代，细胞状态不好时后面传代可以不用离心。

避免细胞抱团：HL60 细胞往往会有“抱团”现象，抱团生长或死亡，勤换液或传代，尽量避免细胞抱团。

使用较大培养瓶：HL60 细胞生长迅速，强烈建议用较大的培养瓶养，用小瓶养的话，换液不及时，很容易死亡。

防污染：HL60 细胞生长迅速，较少发生污染，但常规措施应该做好。比如无菌操作，酒精消毒等，培养瓶口建议过火，包括瓶盖，应过火 4 秒左右。

三、常见问题及解决方案

1.HL-60 细胞生长慢、状态差怎么办？

解决方法：当细胞传代后生长速度慢且状态不佳时，可竖着培养直到培养基变黄，待细胞密度起来后，状态会有所好转。以 T25 瓶子为例，瓶子里有 5mL 培养基，竖起瓶子静置一段时间（竖瓶前拍拍瓶子，让轻贴底部的细胞团浮起来），待细胞沉底（肉眼观察细胞沉底情况），小心吸出 2.5mL 的培养基，转移到离心管，离心 1000rpm 3~5 分钟，用 2.5mL 新鲜培养基重悬后再放回原瓶。

2.HL-60 细胞什么时候传代？

传代时机：HL-60 细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。

3.HL-60 细胞用什么培养基？

培养基配方：80%IMDM+20%FBS+PS。