荧光定量PCR其本质是通过荧光探针或荧光DNA结合染料和实时荧光定量PCR仪器对PCR扩增产物进行检测和定量，仪器在PCR热循环的过程中测量荧光。RT-qPCR(定量逆转录 PCR)主要是指以 RNA 作为起始材料进行定量 PCR 实验的方法。需要首先从样本中提取总 RNA 或信使 RNA(mRNA)、再通过逆转录获取 cDNA 模板，最后进行实时荧光定量 PCR 实验。目前，RT-qPCR 根据其实验步骤的不同，可分为“一步法”与“两步法”。
RT-qPCR的一步法与两步法
一步法RT-qPCR把逆转录与PCR扩增结合在一起，使逆转录酶与DNA聚合酶在同一管内同样缓冲液条件下完成反应。一步法RT-qPCR只需要利用序列特异性引物。在两步法RT-qPCR中，逆转录和PCR扩增过程是在两个管中完成，使用不同的优化的缓冲液、反应条件、以及引物设计策略。
一步法与两步法RT-qPCR示意图
一步法 RT-PCR
cDNA 合成与 qPCR 反应在同一管内同一缓冲液条件下进行，一步完成，这种方法能克隆微量 mRNA 而不需构建 cDNA 文库，省略了 cDNA 与 qPCR 反应之间体系转换的过程。
两步法 RT-PCR
首先用逆转录酶合成 cDNA，然后以 cDNA 为模板进行 qPCR 扩增，即 RNA 反转录与 qPCR 扩增分两步进行。使用不同的优化的缓冲液、反应条件、以及引物设计策略。
一步法的优缺点
优点：
1.由于两步反应都在一个管中完成，因此该方法具有更少的实验误差;
2.一步法操作简便，加样环节少，更少的移液步骤能够减少污染的风险;
3.适用于高通量扩增/筛选，快速且可重现性高。
缺点：
1.无法分别对两步反应进行优化;
2.一步法无法保存反转录后的 cDNA 产物，无法分别对两步反应进行条件优化，因此灵敏性不如两步法;
3.单一样品检测的靶点数较少;4. 上下游基因特异性引物在42℃-50℃下更易发生二聚体聚合，从而导致非特异扩增;
两步法的优缺点
优点：
1.中间产物 cDNA 能够建立可以长期保存，并用于多次反应的稳定的cDNA库;
2.通过oligo dT和随机引物，可以从单个RNA样本中扩增多个靶标，而不需要多重cDNA库;
3. 方便对下游条件优化调整，灵活性强;
4.试验成本低;
缺点：
1.更多的移液步骤会增加DNA污染的风险，并且耗时;
2.相较于一步法，需要进行更多的优化。
