一、实验目的

掌握酵母细胞的培养方法。

学会使用显微镜观察酵母细胞。

二、实验材料

酵母菌种：如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等。

培养基：

YPD（YPD）液体培养基：用于酵母菌摇培。配方为：细菌培养用蛋白胨2g，细菌培养用酵母提取物1g，葡萄糖2g（配成40%葡萄糖贮液单独灭菌，4℃保存），加蒸馏水至90mL，调pH值至4-5，定容至95mL，高温灭菌（121℃，15分钟）。待温度降至55℃时，加入5mL预热（至少室温放置30分钟）无菌的40%葡萄糖贮液。

YPD（YPD）固体培养基：用于保菌或培养。在YPD液体培养基的营养物中加入2g琼脂粉，加蒸馏水至90mL，调pH值至5.8，定容至95mL，高温灭菌（121℃，15分钟）。待温度降至55℃时，加入5mL预热（至少室温放置30分钟）无菌的40%葡萄糖贮液。

YPAD（斜面）培养基：用于保菌或培养营养缺陷菌株。在YPD液体培养基中加入硫酸腺嘌呤40mg，琼脂2g，加蒸馏水至90mL，调pH值至5.8（液体调至4左右），定容至95mL，高温灭菌（121℃，15分钟）。待温度降至55℃时，加入5mL预热（至少室温放置30分钟）无菌的40%葡萄糖贮液。分装培养基，倾斜放置形成斜面，每支试管依大小可加入3-5mL培养基。

实验仪器：恒温培养箱、恒温摇床、相差/微分干涉显微镜、普通光学显微镜、接种环、微量取样器、载玻片、盖玻片、滴管、酒精灯、石棉网、火柴等。

三、实验步骤

1. 酵母细胞的培养

无菌操作：在无菌条件下进行所有操作，确保实验环境的清洁。

接种：使用接种环或微量取样器将酵母菌种接种于YPD液体培养基中。

培养：将接种后的培养基放入恒温摇床中，在28-30℃、200rpm的条件下摇培过夜。

2. 酵母细胞的观察

制片：

液体培养物制片：吸取少量过夜培养的酵母细胞悬液，滴在载玻片上，用盖玻片轻轻覆盖，避免产生气泡。

固体培养物制片：从固体培养基上挑取少量酵母细胞，用生理盐水或缓冲液稀释后，滴在载玻片上，用盖玻片轻轻覆盖。

3.染色（可选）：

碘液染色：在盖玻片一边加一滴碘液，从另一边用吸水纸把染液引入盖玻片下。不久就能看到被染成棕褐色的细胞核和变成蓝紫色的淀粉粒。

其他染色方法：根据实验需要，还可以选择其他染色方法对酵母细胞进行染色，以观察细胞的特定结构或成分。

4.观察：

低倍镜观察：先用低倍镜找到清晰的细胞视野。

高倍镜观察：换用高倍镜或油镜仔细观察酵母细胞的形态、大小、内部结构等。注意区分死细胞、活细胞和不同生长阶段的细胞。

四、实验注意事项

1.无菌操作：在整个实验过程中，必须严格遵守无菌操作规程，防止杂菌污染。

2.培养基配制：培养基的配制必须准确，灭菌要彻底，以确保实验结果的可靠性。

3.培养条件：培养条件（如温度、转速、通气量等）对酵母细胞的生长和分化有重要影响，应根据实验需要进行优化。

4.观察方法：在观察酵母细胞时，应选择合适的显微镜和观察方法，以获得清晰的细胞图像。

5.实验记录：及时记录实验过程中的关键数据和观察结果，以便后续分析和总结。

五、实验拓展

1.酵母细胞的三系分化：在特定条件下，酵母细胞可以分化为假菌丝、子囊孢子和子囊等结构，进一步观察这些结构有助于深入了解酵母细胞的生物学特性。

2.酵母细胞的遗传操作：通过基因工程等手段对酵母细胞进行遗传改造，可以研究基因功能、代谢途径等生物学问题。

3.酵母细胞的应用：酵母细胞在食品工业、生物发酵、药物生产等领域有广泛应用，了解酵母细胞的培养和观察方法对于相关领域的研究和应用具有重要意义。