磷酸化蛋白的Western blot（WB）实验没有结果，可能由多种因素导致。
以下是一些可能的原因及相应的解决方案：
一、实验前准备不足
1.不了解研究对象：
在进行实验前，应充分了解研究蛋白的磷酸化位点及水平。可以通过查阅文献或使用如PhosphoSitePlus等蛋白翻译后修饰综合性预测数据库来获取信息。
2.样本选择不当：
若样本的磷酸化水平过低或不表达，实验可能无法检测到磷酸化蛋白。此时，可通过物理或化学方法对样本进行刺激和诱导，以提高磷酸化水平。
二、样品处理不当
1.样品不新鲜或操作不迅速：
磷酸化蛋白容易降解，因此样品必须新鲜，且操作过程要迅速，以尽量减少磷酸化蛋白的降解。
2.试剂和器具未预冷：
所有试剂和实验用具在使用前都应预冷，以降低磷酸化蛋白降解的可能性。
3.未使用蛋白酶和磷酸酶抑制剂：
在裂解液中加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂是防止蛋白降解的关键步骤。这些抑制剂能够抑制细胞内源性和外源性磷酸酶的活性，从而保护磷酸化蛋白不被降解。
4.样品处理过程中的其他问题：
避免使用超声波细胞破碎仪处理细胞，因为超声波可能会破坏磷酸化位点。对于组织样本，应使用液氮预冷的研钵进行研磨。此外，某些磷酸化蛋白在煮沸过程中可能会失去磷酸化位点，因此应避免煮沸处理。
三、实验操作问题
1.上样量不足：
磷酸化蛋白的丰度通常较低，因此上样量必须足够大，以确保能够检测到清晰的磷酸化条带。
2.抗体选择不当或质量不佳：
选择针对磷酸化蛋白的特异性抗体，并确保其质量和适用性。抗体的稀释倍数也需要适当调整，以确保最佳的检测效果。
3.封闭剂选择不当：
避免使用牛奶作为封闭剂，因为牛奶中含有大量的磷酸化酪蛋白，可能会影响磷酸化抗体对靶蛋白的结合。建议使用牛血清白蛋白（BSA）或无蛋白的封闭剂。
4.曝光或压片时间不当：
曝光或压片时间必须适当，不能太长或过短。太长则背景太深可能会盖住目的条带，时间过短则可能没有条带或者条带太浅。可以选择多个时间进行曝光或压片，选择最佳结果。
四、结果分析不当
1.未设置合适的内参：
为了确定观察到的磷酸化水平改变是否是由于磷酸化程度的改变，还是仅仅因为蛋白质本身表达量的改变，除了常用的内参（如Actin、GAPDH等）外，还需要添加一个总蛋白作为参照。这有助于分析磷酸化水平的变化。
2.未识别特异性和非特异性条带：
在磷酸化蛋白WB实验中常常会出现非特异性的条带。需要通过与对照组的比较来进行分析和判断，确保观察到的条带是特异性的目的条带。
综上所述，磷酸化蛋白WB实验没有结果可能由多种因素导致。为了获得可靠的实验结果，需要在实验前进行充分的准备和调研，确保样品处理得当、实验操作规范、抗体选择合适以及结果分析准确。
