外泌体分离的实验方法和注意事项分别如下：
一、实验方法
超速离心法是最常用的分离外泌体的方法，其大致过程如下：
1.去除细胞碎片：根据样本类型（细胞上清/尿液、血清/血浆）获取上清液。
2.加入外泌体沉淀/结合试剂：向上清液中加入外泌体沉淀或结合试剂。
3.静置结合外泌体：使试剂与外泌体充分结合。
4.离心去除上清：通过低速离心和高速离心交替进行，去除上清液。
5.外泌体沉淀：出现白色沉淀，即为外泌体。
6.溶解外泌体沉淀：使用PBS/无核酶水（RNase-free Water）溶解外泌体沉淀。
7.纯化外泌体：利用纯化柱纯化外泌体。
8.低速离心：进行低速离心处理。
9.保存外泌体：将外泌体置于-80℃条件下保存。
二、注意事项
1.样本量：保证一定的样本量，在血清、血浆、尿液等临床样本有限的情况下，可以根据外泌体提取试剂的加入量进行调整。
2.去除外泌体的血清：若获取的细胞外泌体仍需要进行下一步实验探究，其中用到的完全培养基层（1640/DMEM+FBS+PS）内的血清需用到去除外泌体的血清，可购买也可通过差速离心进行去除，但成本较高。
3.RNA分离：使用外泌体试剂盒分离获取外泌体中的RNA时，分离得到的RNA浓度通常较低且纯度不高。
4.表征鉴定：分离获取外泌体后，需要进行表征鉴定，通常使用Western blot鉴定外泌体的表面标志蛋白（CD63、CD9、CD81以及TSG101、HSP70），使用电镜分析外泌体的大小形态（透射电镜TEM，扫描电镜SEM），检测外泌体的粒径及浓度（纳米颗粒示踪分析NTA，DLS粒度分析），使用流式细胞术检测粒径及细胞表面标志物。
5.离心管配平：分离外泌体的过程可能用到15/50ml离心管的离心机，这个比较大型的离心机对于管子的配平十分重要，严格一些的可能还需要对要离心的管子进行称重配平。另外，离心机也会设置最高转速的限制，因此离心过程需要格外注意。也可以进行2ml或5ml的离心管进行分装，使用小型的离心机进行高速离心，但这种情况会导致收集浓度降低。
6.样品保存：已经分离好的外泌体样本如果需要进行电镜观察，只能冰上或4℃保存，存放时间不超过两天，不可冷冻保存，否则可能会影响电镜观察效果。
在进行外泌体分离实验时，务必遵循实验步骤和注意事项，以确保实验的准确性和可靠性。
