一、组织样本的自发荧光来源
组织自发荧光是指生物组织中的某些天然成分在受到特定波长的光激发后会发出荧光的现象。
这些天然成分通常是组织本身的组分，主要包括以下几类：
黄素类物质：如FAD，存在于线粒体中，是能量代谢和电子传递链中的重要代谢物。FAD只有氧化形式可以产生荧光。
卟啉：一种含铁的色素，常见于血红蛋白中，也是重要的背景荧光来源之一。
胶原蛋白和弹性蛋白：这两种蛋白在细胞外基质中含量非常丰富，组织分布也很广，包括皮肤、内脏、血管、肌腱、毛发和指甲等。
红细胞：其中含有大量的卟啉，也是重要的背景荧光来源。
脂褐素：随着细胞和生物体衰老而逐渐积累的一种物质，能够产生自发荧光。
其他物质：如植物叶绿素、NAD(P)H（一种存在于所有活细胞的代谢辅助因子和电子载体，但只有还原形式的NAD(P)H能被激发出荧光）、色氨酸（作为蛋白质的组成成分，其自发荧光信号与蛋白质结构和结合状态有关）等。
此外，组织固定中经常使用的甲醛、戊二醛和福尔马林等也会造成组织的自发荧光。福尔马林可在蓝色、绿色和红色波长光谱范围上产生大量的自发荧光，尤其不适用于免疫荧光检测。
二、组织样本自发荧光的去除方法
为了降低组织自发荧光对实验结果的影响，可以采取以下措施：
1.选择合适的固定液：
使用非醛类固定液，如冰乙醇，可以有效降低因醛类反应所产生的自发荧光。
2.固定前处理：
组织固定前先用PBS灌洗组织，去除红细胞，减少由卟啉产生的自发荧光。
3.使用自发荧光清除试剂：
苏丹黑：一种非荧光重氮染料，可与组织非特异性结合，通过吸收入射光来降低组织的自发荧光。对于由脂褐素引起的自发荧光非常有效，但对于醛类和红细胞等产生的自发荧光效果不佳。
硼氢化钠：作为还原剂，可还原C=C和C=N键，从而减少自发荧光。但硼氢化物在中性pH环境下不稳定，实验重复性较低。
TrueVIEW Quencher：一种新型的自发荧光淬灭剂，使用亲水性的水溶液处理组织切片，可静电结合胶原蛋白、弹性蛋白和红细胞，有效地降低组织中的自发荧光。
4.光漂白：
组织切片长时间暴露于高强度UV辐射下，组织中的成分发生不可逆的光氧化作用，从而降低自发荧光。但该方法耗时太长，且大多数免疫组化实验室均缺乏光漂白方法所需的仪器设备。
5.选择合适的荧光基团：
根据体系中可能存在自发荧光的发射光波长来挑选合适的荧光基团标记，自发荧光和目标荧光信号波长相差大，更易于区分和过滤掉背景荧光。
6.其他方法：
在进行活体成像时，选择近红外荧光蛋白或荧光素酶等发光物质，以减少自发荧光的干扰。
在涉及消化道方面的成像时，提前使用无荧光饲料喂养动物，避免食物中可能含有的荧光物质的影响。
综上所述，组织样本的自发荧光来源复杂多样，但通过选择合适的固定液、固定前处理、使用自发荧光清除试剂、光漂白、选择合适的荧光基团以及其他方法，可以有效地降低自发荧光对实验结果的影响。
