一、试剂配制
1.1mol/L HCl溶液:将8.5毫升浓盐酸加入91.5毫升蒸馏水中,混匀即可。
2.Schiff试剂:为无色品红亚硫酸溶液,需新鲜配制,具体配制方法较为复杂,建议参考专业实验室的配制方法。
3.0.5%亮绿水溶液:用于复染细胞质,使细胞质呈现绿色,便于观察。
二、染色步骤
1.细胞准备:取培养于盖玻片上的贴壁原代细胞,用Hanks液漂洗三次,以去除残留的培养液和杂质。
2.细胞固定:将细胞置于卡诺(Carnoy)固定液中固定10分钟,然后用蒸馏水洗三次。卡诺固定液通常由乙醇和冰醋酸按一定比例混合而成,具有良好的固定效果。
3.酸水解:将固定后的细胞移入60℃的1mol/L HCl溶液中,静置10分钟。这一步是关键步骤,需要严格控制温度和时间,以确保DNA的水解程度适中。
4.中和与漂洗:用蒸馏水漂洗细胞几次,以去除残留的HCl。
5.Schiff试剂染色:将细胞置于Schiff试剂中,避光静置30-60分钟。染色过程中应随时检查显色情况,避免染色过度。
6.冲洗:用自来水冲洗细胞5分钟,以去除多余的Schiff试剂。
7.复染:用0.5%亮绿水溶液复染细胞质数秒钟,然后用蒸馏水漂洗。
8.脱水与封片:用不同浓度梯度的乙醇溶液对细胞进行脱水处理,然后用二甲苯透明,最后用光学树胶封片。
三、染色结果
染色完成后,在显微镜下观察,可以看到原代细胞核因含有DNA而呈现紫红色,细胞质因被亮绿复染而呈现绿色。这一结果清晰地显示了DNA在细胞内的分布情况。
四、注意事项
1.试剂配制:Schiff试剂需新鲜配制,并避光保存。HCl溶液的浓度和温度需严格控制,以确保水解效果。
2.染色步骤:染色过程中应严格控制时间和温度,避免染色过度或不足。特别是在Schiff试剂染色步骤中,应随时检查显色情况。
3.显微镜观察:观察前应将细胞充分湿润,以避免细胞干燥导致形态变化。同时,使用适当倍数的显微镜观察细胞,以获得清晰的图像。
通过原代细胞富尔根反应,可以清晰地观察到细胞内DNA的分布情况,为细胞生物学和医学研究提供重要的实验依据。