一、线性范围的定义
线性范围是指利用一种方法取得精密度、准确度均符合要求的试验结果，且成线性的供试物浓度的变化范围。在Western Blot中，线性范围是指条带强度与膜上目标蛋白成比例的区域。随着蛋白量增加，条带强度应该增加，且这种增加是线性的。
二、线性范围对Western Blot定量的影响
1.定量准确性：
当目标蛋白和上样对照（如内参蛋白）两者的线性范围重叠时，Western Blot定量结果才是真正准确的。如果线性范围不重叠，那么一种蛋白浓度的变化可能只影响一种蛋白的条带强度，而不影响另一种，这会导致定量结果不准确。
2.实验设计的复杂性：
当考虑上样质控对照时，线性范围的重叠情况会使实验设计变得更加复杂。例如，评估高表达的看家基因相关联的低丰度蛋白时，由于两者的线性范围可能不重叠，定量就变得困难。
3.实验操作的灵活性：
如果线性范围不重叠，可能需要调整实验条件，如改变上样质控方法、使用总蛋白定量作为质控手段等，以适应线性范围的要求。
三、如何确定Western Blot的线性范围
确定Western Blot的线性范围相对容易，可以通过对样品进行连续稀释来实现。具体步骤如下：
1.准备已知浓度的蛋白标准品：
使用已知浓度的蛋白标准品进行梯度稀释，以覆盖预期的蛋白浓度范围。
2.进行Western Blot实验：
按照常规的Western Blot实验步骤进行操作，包括电泳、转膜、封闭、抗体孵育和成像等。
3.分析成像结果：
使用图像分析软件对成像结果进行分析，绘制条带强度与蛋白浓度之间的关系曲线。
4.确定线性范围：
通过观察关系曲线，找出条带强度与蛋白浓度成线性关系的区间，即为线性范围。
四、注意事项
1.曝光时间：
曝光时间对Western Blot成像的动态范围有重要影响。过长的曝光时间可能导致信号过饱和，而曝光时间不足则可能使信号过弱。因此，在确定线性范围时，应选择合适的曝光时间。
2.抗体选择：
抗体的特异性和灵敏度对Western Blot定量结果有显著影响。应选择特异性高、灵敏度好的抗体进行实验。
3.实验重复性：
为了确保定量结果的可靠性，应进行多次重复实验，并对实验结果进行统计分析。
