一、实验准备
1.材料准备：
培养好的细胞或组织样品。
TRIzol试剂或其他RNA提取试剂。
离心管（如5ml或更大容量的密封管）。
氯仿、异丙醇、75%乙醇等试剂。
2.设备准备：
配备近重直（小倾角10°）转头的超速离心机。
移液枪、离心机、计时器等实验设备。
二、RNA提取与初步处理
1.细胞或组织裂解：
对于细胞，使用TRIzol试剂进行裂解，通常每1×10^7个细胞加入1ml TRIzol试剂。
对于组织，每100毫克新鲜组织加入1毫升TRIzol试剂，并使用匀浆器进行匀浆处理。
2.相分离：
在裂解液中加入氯仿，充分振荡后静置，使核蛋白复合物完全解离。
通过离心将溶液分为三层，上层为含有RNA的水相。
三、超速离心分离
1.样品装载：
将含有RNA的水相转移到超速离心管中，并使用近重直（小倾角10°）转头进行装载。
确保离心管密封良好，以避免离心过程中液体泄漏。
2.离心参数设置：
根据离心机的型号和转头的特性，设置适当的离心参数，如转速、温度和离心时间。
通常，超速离心需要在较低的温度下进行，以减少RNA的降解。
3.离心操作：
启动离心机，并按照设定的参数进行离心操作。
在离心过程中，注意观察离心机的运行状态和离心管的密封情况。
4.RNA沉淀与收集：
离心结束后，RNA通常会沉淀在离心管的底部。
使用适当的工具（如移液枪）将RNA沉淀收集到新的离心管中。
四、RNA洗涤与溶解
1.洗涤：
使用75%乙醇对RNA沉淀进行洗涤，以去除残留的杂质和试剂。
通过离心将乙醇去除，并重复洗涤步骤一次或多次。
2.溶解：
将洗涤后的RNA沉淀用适量的无核酶水进行溶解。
室温放置一段时间，使RNA充分溶解。
3.浓度测定与保存：
使用分光光度计或其他适当的仪器测定RNA的浓度和纯度。
将RNA溶液保存在-80℃冰箱中，以避免降解和污染。
五、注意事项
1.操作规范：
在整个实验过程中，应严格遵循实验室的操作规程和无菌操作要求。
使用经清洗的试剂和器皿，避免RNase等污染。
2.离心机使用：
在使用超速离心机时，应确保离心机的稳定性和安全性。
遵循离心机的使用说明和操作规程，避免超速或过载运行。
3.样品处理：
在处理样品时，应注意避免机械损伤和温度变化对RNA的影响。
确保样品在离心过程中的稳定性和均匀性。
