质粒小提实验步骤:
1.柱平衡
吸附柱中注入500ul的平衡液BL,以12,000rpm离心1分钟,然后废弃上清液。
2.裂解,中和
①以12,000rpm或4000rpm离心菌液10分钟,将溶解P1溶液(含有缓冲液,用于重新悬浮细菌)加入至离心管中的菌体沉淀,进行充分涡旋或吹打,使菌体重新悬浮。如果菌量较多,可以增加P1的用量。
②加入与P1等体积的P2溶液(裂解液,强碱性),轻轻上下颠倒6-8次,确保菌体充分裂解,操作时请注意轻柔,并确保不超过5分钟。如果菌液未变清澈,可能是因为菌体过多,裂解不彻底。
③在离心管中加入与P1等体积的P4溶液(中和碱性环境,用于沉淀蛋白质),立即轻轻颠倒6-8次混匀,会出现白色絮状沉淀,然后室温静置10分钟,12,000rpm离心10分钟。
3.分离DNA
①将上一步获得的上清液分批加入过滤柱(每次不超过700ul),12,000rpm离心2分钟,收集滤液。
②向滤液中添加0.3倍滤液体积的异丙醇(加入过多异丙醇容易导致RNA污染)。
③将滤液转移到吸附柱中(每次不超过700ul),以12,000rpm离心1分钟,弃掉滤液。
4.洗涤DNA
①向吸附柱中添加500μl去蛋白液PD,以12,000rpm离心1分钟,废弃上清液。
②向吸附柱中加入600μl漂洗液PW(请事先检查是否已加入无水乙醇),以12,000rpm离心1分钟,弃掉上清液。重复一次。
③以12,000rpm离心2分钟,彻底去除吸附柱中残余的漂洗液。
5.洗脱DNA
洗脱DNA 将吸附柱放置在干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加100-300ul洗脱缓冲液TB,室温静置2分钟,以12,000rpm离心1分钟,将质粒溶液收集至离心管中。为了提高质粒的回收率,可以将所得溶液重新加入离心吸附柱中,重复离心。