WB避坑指南

Western Blot（WB）作为一种常规用于研究蛋白质分离和鉴定的技术，虽然看似简单，但实际操作中却有许多需要注意的细节。以下是一份WB避坑指南，帮助科研人员更好地进行实验：

一、实验前准备

1.样本处理：

使用物理或化学方法破碎组织或细胞，加入适量裂解液及酶抑制剂。裂解液的用量需根据样本量适当调整，如30mg的组织可加入500μl的RIPA裂解液（含酶抑制剂），一个6孔板的细胞可加60μL裂解液（含酶抑制剂）。

裂解后建议进行超声处理，以破坏膜结构、断裂DNA、降低样本粘稠度，使样本更加均质化，增加蛋白的溶解性。

2.蛋白浓度测定：

采用BCA试剂盒测定总蛋白浓度，通过代入标准品浓度曲线，以OD 562nm吸收值定量蛋白浓度。

 

二、电泳与转膜

1.电泳：

按照试剂盒说明书分别配制下/上层胶，并选择合适的梳齿。

根据目的蛋白分子量适当调整电泳时间，一般可先以100V恒压电泳30min，再转换为150V恒压电泳至目的蛋白分离开。

2.转膜：

按照说明书配制转膜液，PVDF膜需以甲醇激活60s。

按照纤维垫--滤纸—PVDF膜—凝胶—滤纸--纤维垫的顺序制作三明治夹，充分赶走气泡。

根据目的蛋白分子量大小选择转膜时间，一般可选择220mA恒流转膜，并注意加冰以防过热。

 

三、抗体孵育

1.封闭：

按照说明书配制封闭液，一般室温封闭20-30min，摇床转速80rpm。

2.一抗孵育：

根据目的蛋白选择对应的一抗，稀释倍数参考说明书，4℃过夜孵育。

孵育结束后，用TBST洗膜三次，每次5min，摇床转速100rpm。

3.二抗孵育：

根据一抗的种属选择对应二抗，稀释倍数参考说明书，常温孵育1-2h，摇床转速80rpm。

同样以TBST洗膜三次，每次5min，摇床转速100rpm。

 

四、显影与结果分析

1.配制ECL化学发光液：

按照说明书配制ECL化学发光液，并设置合适的曝光时间进行显影。

2.结果分析：

仔细观察显影结果，注意条带的清晰度、位置及是否有非特异性条带等。

如出现无目的蛋白、内参不齐、条带变形或高背景等问题，需及时排查原因并调整实验条件。

 

五、其他注意事项

1.设立阳性对照：

当对一个靶标并无检测经验时，在实验初期应增加阳性对照以帮助排查问题。

2.封闭液的选择：

对于磷酸化蛋白的封闭，建议使用新鲜配置的牛奶而非BSA，因为牛奶的封闭效果优于BSA且不会对磷酸化信号产生影响。

3.实验记录：

详细记录实验过程中的所有信息（如抗体稀释比例、孵育温度和时间、洗涤次数等），以便日后跟踪和重复实验。

 

试用装申请活动

在生物医学研究领域，抗体是实现精确分子检测和靶向治疗的关键工具。然而，市场上抗体质量参差不齐，如何在众多产品中快速找到高效、专一性强的抗体是每位科研人员面临的挑战。为了降低科研成本并提高实验效率，许多抗体供应商会开展试用装申请活动。以下是一些关于抗体试用装申请的建议：

1.选择可靠的供应商：

优先选择有良好口碑和丰富经验的抗体供应商进行申请。

2.了解申请流程：

访问供应商官方网站或相关平台，了解试用装申请的具体流程和要求。

3.填写申请表格：

根据要求填写申请表格，包括研究方向、预期使用的抗体及实验类型等信息。这些信息将有助于供应商评估并确定最适合您需求的抗体试用装。

4.等待审核与发货：

提交申请后耐心等待供应商审核。一旦审核通过，试用装抗体将会安排发货。

5.进行实验验证：

收到抗体后按照随附的产品说明书进行实验验证。同时保持与供应商技术支持的沟通以便解决实验过程中可能遇到的问题。

6.提交反馈：

完成实验后整理数据并向供应商提交实验结果与反馈。这不仅有助于改进产品性能还可以作为后续购买折扣或其他优惠政策的依据。