抗体偶联APC-Cy7的流程通常涉及多个步骤，这些步骤需要精确操作和适当的实验条件以确保偶联的成功和效率。
以下是一个详细的流程概述：
一、准备阶段
1.试剂准备：
准备APC-Cy7染料及其活化所需的试剂，如SMCC（琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯）等。
准备抗体修饰所需的试剂，如DTT/TCEP（二硫苏糖醇/三(2-羧乙基)膦）等。
准备适当的缓冲液，如PBS（磷酸盐缓冲液）、MES（2-(N-吗啡啉)乙磺酸）缓冲液等。
2.抗体处理：
将抗体（纯度>90%）的浓度调节至约5-10 mg/ml，使用PBS缓冲液进行稀释。
向每毫克抗体中加入适量的抗体修饰缓冲液（如DTT/TCEP溶于ddH2O中制备的2 mg/ml溶液），轻轻混合，并在室温下搅拌混合物60-90分钟，以还原抗体的二硫键。
二、APC-Cy7活化
1.溶解APC-Cy7：
将APC-Cy7溶于适当浓度的PBS（如0.1M，pH 7.4，含5mM EDTA）中，制备成合适的浓度（如5-10 mg/ml）。
2.活化APC-Cy7：
将SMCC溶解在无水二甲基亚砜（DMSO）中，制备成高浓度的储备溶液（如10 mg/ml）。
按照一定的比例（如APC-Cy7:SMCC=1:80）将SMCC添加到APC-Cy7溶液中，用铝箔密封反应混合物，并在室温下旋转反应一段时间（如1小时），以使APC-Cy7上的氨基与琥珀酰亚胺酯反应，形成活化的APC-Cy7。
3.纯化活化的APC-Cy7：
将反应混合物转移到超滤离心管中，并在适当条件下离心（如4℃，12000g，5分钟）以除去滤液。
多次加入MES缓冲液，混合并离心，以彻底清除未反应的SMCC和其他杂质。
三、抗体与APC-Cy7偶联
1.调节浓度：
将修饰后的抗体和活化的APC-Cy7分别调节至适当的浓度（如抗体1-5 mg/ml，APC-Cy7 5 mg/ml）。
2.偶联反应：
按照一定的比例（如抗体:APC-Cy7=1:1.3）将修饰后的抗体与活化的APC-Cy7混合，在室温下进行反应，避光反应一段时间（如2小时），使抗体与APC-Cy7偶联。
3.阻断未反应基团：
在反应混合物中加入适量的NEM（N-乙基马来酰亚胺）溶液（如溶解在无水DMSO中的12.5 mg/ml溶液），每毫克抗体加入一定量（如5μl）的NEM溶液，以阻断任何剩余的活性基团。
4.纯化偶联产物：
将反应混合物转移到离心过滤管中，通过重复离心去除未结合的APC-Cy7和其他杂质。
四、储存与使用
1.储存：
将标记好的抗体分成等分，添加适当的防腐剂，并在适当的条件下储存（如-20°C），以备将来使用。
2.注意事项：
激活的APC-Cy7应在黑暗中冷藏，避免光线照射。
封闭试剂和修饰试剂应新鲜配制，并立即使用，避免长时间存放。
标记的抗体应具有高特异性和不低于90%的纯度。
通过以上步骤，可以成功地将APC-Cy7偶联到抗体上，制备出用于流式细胞术等实验的荧光标记抗体。
