一、荧光显微镜观察法
步骤：
1.样本收集：采集外周血或分离中性粒细胞（如从健康人或患者血液中分离）。
2. 细胞培养：将中性粒细胞接种于培养板中（如24孔板），密度为1×10^5cells/mL，使用RPMI 1640培养基（含10%胎牛血清）。
3. 刺激NETs形成：加入刺激剂（如PMA，100 nM）或病原体（如金黄色葡萄球菌），37°C、5% CO₂培养3-4小时。
4.固定细胞：加入4%多聚甲醛固定15分钟，PBS洗涤3次。
5. 染色：使用Sytox Green（1 μM）或DAPI（1 μg/mL）染色15分钟，避光。
6. 显微镜观察：使用荧光显微镜观察NETs（激发波长：488 nm，发射波长：520 nm）。
注意事项：
1.避免光照过强，防止荧光淬灭。
2.染色后尽快观察，避免长时间放置。
二、流式细胞术
步骤：
1. 样本收集：分离中性粒细胞（如使用Ficoll密度梯度离心法）。
2. 刺激NETs形成：加入PMA（100 nM）或病原体，37°C、5% CO₂培养3-4小时。
3. 标记NETs：加入荧光标记抗体（如抗组蛋白H3抗体，1:100稀释；抗MPO抗体，1:100稀释），4°C避光孵育30分钟。
4. 洗涤：用PBS洗涤2次，去除未结合抗体。
5. 流式检测：使用流式细胞仪检测荧光信号（如FITC通道检测组蛋白，PE通道检测MPO）。
注意事项：
1.抗体浓度需优化，避免非特异性结合。
2.样本处理需轻柔，避免细胞破碎。
三、 ELISA检测法
步骤：
1.样本收集：收集细胞培养上清液或血浆样本。
2. 包被酶标板：使用抗组蛋白H3抗体（1:1000稀释）或抗DNA抗体包被96孔板，4°C过夜。
3.封闭：加入5% BSA封闭1小时，37°C。
4. 加样：加入样本（100 μL/孔），37°C孵育2小时。
5. 检测抗体：加入HRP标记的二抗（1:5000稀释），37°C孵育1小时。
6. 显色：加入TMB显色液（100 μL/孔），室温避光反应15分钟。
7. 终止反应：加入2 M H₂SO₄终止反应（50 μL/孔）。
8. 读取吸光度：使用酶标仪读取450 nm吸光度值。
注意事项：
1.封闭要充分，避免非特异性结合。
2.显色时间需控制，避免过显色。
四、 DNA定量法
步骤：
1.样本收集：收集细胞培养上清液或血浆样本。
2. DNA提取：使用DNA提取试剂盒提取DNA（如Qiagen DNA提取试剂盒）。
3.定量检测：使用PicoGreen荧光染料（1:200稀释）与DNA结合，室温避光孵育5分钟。
4. 荧光检测：使用荧光光度计检测荧光强度（激发波长：480 nm，发射波长：520 nm）。
注意事项：
1.DNA提取需避免降解。
2.PicoGreen染色需避光操作。
