Q-PCR（实时荧光定量PCR）实验操作流程主要包括实验准备、RNA提取、逆转录、配置反应体系、上机操作及数据分析等步骤。以下是对这些步骤的详细解释：
一、实验准备
1.器材准备：超净台、移液枪、无酶枪头、八联管及管盖、EP管、八连管架等。
2.试剂准备：qPCR Mix、引物、DEPC水、稀释好的cDNA等。
3.实验设计：根据实验组和对照组、样品数、基因数量设计好96孔板上的排板布局。通常，同一个基因做至少3个重复放置于同一横排，方便计算取平均值。一个基因同时也要保证至少3组生物学重复。目的基因中，通常至少包含一个内参基因，例如GAPDH或者β-actin，后续数据处理时，内参基因将作为参考值，用于计算相对表达量。
二、RNA提取
1.细胞或组织处理：
细胞样品：用PBS清洗后，加入Trizol溶液吹打混匀，使细胞充分裂解。
组织样品：用液氮充分研磨后，加入Trizol溶液混匀，室温放置使其充分裂解。
2.RNA提取与纯化：
加入氯仿剧烈振荡混匀，室温静置后离心分离。
取上层水相移至新的EP管中，加入等体积异丙醇混匀，室温静置后离心收集RNA沉淀。
用75%乙醇洗涤沉淀后，超净台风干，加入适量DEPC水溶解沉淀。
三、逆转录
1.去除基因组DNA：使用RNase-free的DNase I消化RNA中的基因组DNA。
2.逆转录反应：在RNase-free的PCR管中配置逆转录体系，包括RNA模板、逆转录酶、引物等，进行逆转录反应，合成cDNA。
四、配置反应体系
1.预冷器材：枪头和板子可提前放入冰箱预冷，以减少气泡产生。
2.计算试剂用量：根据排板布局计算所需试剂用量，每12孔多计算2个孔以备不时之需。
3.配置预混试剂：确保qPCR mix解冻完全并混匀，引物要多次涡旋离心防止形成引物二聚体。
4.分装反应液：在八连管架上放置好八连管，依次加入qPCR Mix、引物+水、cDNA等试剂，确保所有试剂均未挂壁后盖上盖子，离心混匀至无气泡。
五、上机操作
1.设置反应程序：将配置好的反应液放入实时qPCR仪中，设置相应的温度循环和采集模式。通常包括预变性、变性、退火和延伸等步骤。
2.扩增检测：进行扩增检测并收集荧光信号。
六、数据分析
1.结果判断：根据扩增曲线和熔解曲线分析实验结果。理想的扩增曲线应为“S”型曲线，熔解曲线应为单一峰。
2.数据导出：反应结束后得到qPCR数据，导出数据为EXCEL文件并保存。
3.相对定量：采用比较Ct法（如△△Ct法）进行相对定量分析，计算目的基因在不同样本中的相对表达量。
七、注意事项
1.实验操作：实验过程中需佩戴干净的橡胶手套和口罩，避免RNA酶污染。在冰上操作并注意避光。
2.仪器校准：定期进行仪器校准保养以确保实验结果的准确性。
3.常见问题处理：如遇到非特异性扩增、引物二聚体等问题需针对具体情况进行调整和优化。
以上是Q-PCR实验的完整操作流程和注意事项。在实验过程中需严格按照操作规范进行以确保实验结果的准确性和可靠性。
