实时荧光定量PCR（Real-time PCR，QPCR，荧光定量）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法，能够实现对靶DNA的定量分析。以下是实时荧光定量PCR的分类以及实验步骤的介绍：
一、分类
实时荧光定量PCR根据所用荧光物质的化学原理和PCR检测的特异性，可分为以下几类：
1.DNA结合染料法：
原理：与双链DNA小沟结合的荧光染料，不与单链DNA结合，而与双链DNA结合时会发出荧光，从而进行实时监测。
常用染料：SYBR Green I、Eva Green等。
特点：可检测所有双链DNA扩增产物，包括非特异反应产物，如引物二聚体。不需要探针，减少了实验设计及运转成本，适合于大量基因的分析，但易产生假阳性现象。
2.探针化学法：
Taqman探针法：
原理：在PCR扩增时加入一对引物的同时，再加入一个特异性的荧光探针。该探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。
特点：仅检测特异性扩增产物，特异性优于DNA染料法，更适用于病原体检测，但原料成本较高。
分子信标法：
原理：分子信标是一种在5'和3'末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针。两端的核酸序列互补配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。PCR产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定DNA序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光。
特点：具有高灵敏、高特异、操作简便、灵敏度高、特异性强等特点，还可用于活体分析，但合成探针成本较昂贵。
二、实验步骤
实时荧光定量PCR的实验步骤通常包括以下几个方面：
1.样品准备：
提取目标DNA或RNA。对于RNA样本，还需进行反转录成相应的cDNA。
2.预处理：
纯化提取的DNA/cDNA，去除污染物。
3.设计引物和探针：
根据目标序列设计特异性引物和荧光探针。
4.准备反应体系：
按照说明书要求，配制引物、探针（如使用）、模板、聚合酶、缓冲液等。
5.执行PCR循环：
将反应体系装入热循环仪并进行PCR循环。检测DNA变性、引物结合、扩增和荧光信号等。
6.数据分析：
根据荧光信号的变化，分析Ct值（循环阈值），即每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环次数。利用已知起始拷贝数的标准样品绘制标准曲线，通过标准曲线计算待测样本的起始拷贝量。
综上所述，实时荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性强、定量准确等优点，在基因表达分析、病原体检测、基因型分析等领域具有广泛应用。在实验过程中，需要严格遵循实验步骤和注意事项，以确保实验结果的准确性和可靠性。
