全血基因组DNA提取的操作步骤可以归纳为以下详细流程,但请注意,不同实验室或试剂盒可能会有所差异,以下步骤提供了一种常见的方法:
一、材料准备
1.抗凝全血样本
2.细胞裂解液
3.Proteinase K溶液
4.缓冲液(如GB、GD、PW等,具体名称可能因试剂盒不同而异)
5.吸附柱及收集管
6.洗脱缓冲液
7.离心管(如1.5ml、15ml等)
8.移液器及吸头
9.涡旋振荡器
10.离心机
11.水浴锅
12.冰盒
二、操作步骤
1.样本处理:
取适量抗凝全血(如1ml)放入15ml离心管中。
如需处理更大体积血液,可加入3倍体积红细胞裂解液,颠倒混匀后室温放置,再离心去除上清,留下白细胞沉淀。
2.细胞裂解:
将处理后的血液或白细胞沉淀加入细胞裂解液,颠倒混匀。
加入Proteinase K溶液,混匀后置于水浴锅中进行裂解反应,期间需颠倒混匀数次。
3.DNA释放与纯化:
加入缓冲液GB(或其他相应缓冲液),充分颠倒混匀后置于水浴锅中。
加入无水乙醇或异丙醇,混匀后出现絮状沉淀。
将溶液和沉淀转移至吸附柱中,离心去除废液。
向吸附柱中加入漂洗液(如PW),离心后弃去废液,重复此步骤一次或多次。
将吸附柱空离一次,以彻底去除残余漂洗液。
4.DNA洗脱与收集:
将吸附柱移至干净的离心管中。
向吸附膜中间位置悬空滴加洗脱缓冲液(如TE),室温放置一段时间后离心收集DNA溶液。
如需增加DNA得率,可将离心得到的溶液再次加入吸附柱中,重复洗脱步骤。
5.DNA浓度测定与保存:
使用分光光度计测定DNA浓度和纯度。
将DNA溶液保存于-20℃冰箱中,以防降解。
三、注意事项
1.在操作过程中应严格遵循无菌原则,避免DNA污染。
2.离心时应注意转速和时间,避免DNA损失。
3.不同试剂盒的缓冲液成分和比例可能有所不同,应严格按照说明书进行操作。
4.在进行DNA洗脱时,洗脱缓冲液的体积和pH值对洗脱效率有很大影响,应选择合适的洗脱条件。
以上步骤提供了一种全血基因组DNA提取的常规方法,但具体步骤可能因实验室条件和试剂盒的不同而有所调整。在实际操作中,应严格遵循所用试剂盒的说明书进行操作,以确保提取效果和实验结果的准确性。