确定蛋白质发生翻译后修饰（Post-Translational Modification, PTM）的位点，通常需要综合运用多种实验方法和生物信息学方法。以下是一些常用的方法：
质谱分析
质谱分析是鉴定翻译后修饰位点的最常用方法。其基本原理在于，经过不同修饰的蛋白或多肽，其分子质量都会增加相对应的官能基团的值。例如，发生磷酸化修饰时，连接磷酸基团的氨基酸残基分子质量会在原来的基础上增加97Da；若发生乙酰化修饰，相对分子质量则增加42Da。
实际操作时，首先需要对蛋白质进行酶解（如胰蛋白酶），生成肽段，然后利用质谱仪对肽段进行测量。质谱数据可以提供肽段的质量和荷质比信息。根据修饰引起的质量变化，可以确定修饰发生在哪个氨基酸残基。此外，通过对二级质谱（MS/MS）数据进行分析，可以进一步确认修饰位点的位置。
生物信息学预测
有多种生物信息学工具和算法可以预测蛋白质的翻译后修饰位点。这些工具通常基于已知的修饰数据和蛋白质序列特征进行预测。例如，NetPhos可以预测蛋白质的磷酸化位点，GPS则可以预测多种类型的修饰位点。但需要注意的是，生物信息学预测方法可能存在假阳性和假阴性，因此应该与实验数据相结合进行验证。
分子生物学实验验证
通过分子生物学实验可以验证和鉴定蛋白质的修饰位点。例如，通过使用特异性抗体，可以检测到某些修饰（如磷酸化、乙酰化等）的特定位点。另外，利用定点突变技术可以将疑似修饰的氨基酸残基替换为其他残基，然后通过功能实验和表达分析等方法验证修饰位点的影响。
干扰实验
可以使用特异性抑制剂或酶来干扰翻译后修饰的过程，然后观察蛋白质的功能和表达变化，从而推测翻译后修饰位点。
结构生物学方法
利用蛋白质的三维结构信息，如X射线晶体学、核磁共振（NMR）或冷冻电子显微镜（Cryo-EM）等，可以观察到蛋白质的修饰位点和结构变化。这有助于研究者更好地了解翻译后修饰对蛋白质结构和功能的影响。
综上所述，确定蛋白质发生翻译后修饰的位点需要综合运用多种方法。这些方法各有优劣，因此在实际操作中需要根据实验目的和条件进行选择和优化。
