细胞培养技术中的细胞消化是一个关键环节，其中酶消化法是目前应用最广泛的方法。
以下是对酶消化法的详细介绍：
一、实验前准备
1.试剂与耗材：所有与细胞接触的试剂和耗材必须经过灭菌处理，以确保无菌操作。
2.实验环境：实验应在超净工作台中进行，以避免微生物污染。
3.试剂温度：实验中需要使用的试剂应提前恢复至使用温度，以确保实验的准确性和稳定性。
二、操作方法
1.取出细胞：从培养箱中取出细胞，并弃去原有的细胞培养基。注意勿直接倾倒液体，以免对细胞造成损伤。
2.添加PBS：向培养皿侧壁缓慢添加PBS（每10cm²培养表面积用量约2mL），以免干扰细胞层。轻柔转动培养皿使PBS完全覆盖细胞层。
3.弃去PBS：轻轻晃动培养皿后，弃去PBS。
4.添加胰蛋白酶：向培养皿一侧添加胰蛋白酶（每10cm²约1~2mL），轻柔转动培养皿以完全覆盖细胞层。胰蛋白酶能够消化连接细胞及培养底物的蛋白质，使细胞分离。
5.孵育：室温下孵育约1~2分钟。对于较难消化的细胞，可置于37℃培养箱内消化。实际孵育时间随消化液种类和细胞系而异。
6.观察细胞状态：在显微镜下观察细胞是否脱壁。如果细胞脱离不到90%，则继续孵育，并每隔一段时间检查消化状况。当细胞体积缩小、间隙变宽、用枪轻吹细胞可以脱壁时，表示消化适度。
7.终止消化：添加3倍胰蛋白酶体积的完全培养基以终止消化（完全培养基内的血清可终止胰酶的消化）。敲击瓶身使细胞脱落，倾斜培养皿，使用移液器吸取细胞悬液将细胞吹落于一侧。
8.收集细胞：将细胞转移到一个无菌的离心管中，以1000rpm的速度离心5分钟，然后弃去上清液。
9.细胞重悬与计数：将细胞沉淀重悬于适量完全培养基中，吹散为单细胞悬液。取出适量样品进行计数，可以使用血细胞计数仪、细胞计数仪、台盼蓝细胞染色法或自动细胞计数仪等方法测定细胞总数和活细胞百分比。
10.接种与培养：将细胞悬液稀释至细胞系的推荐接种密度，然后转移至新的细胞培养皿中。或在新的培养皿内提前加好适量培养基，将细胞悬液按推荐接种密度均匀接种至培养皿内，混匀培养基和细胞悬液后，将细胞放回培养箱继续培养。
三、注意事项
1.消化时的细胞状态：在显微镜下观察细胞状态，当细胞多半呈沙状移动时即可停止消化。不要等到所有细胞完全分离才停止，以避免过度消化。
2.细胞形态：部分细胞（如U87、U251）消化后不会变成圆形，但仍可表现为原有细胞形态。在镜下观察时，这些细胞可能呈飘动状。
3.避免过度消化：过度消化会导致细胞损伤和死亡。在传代后，这些受损细胞可能会漂浮在培养液表面，形成肉眼可见的小片白色膜状物。如果细胞团中仍存在有活力的细胞，它们会贴壁并造成局部细胞密度不均匀。该细胞团贴壁后会形成中央坏死细胞区。
酶消化法具有效率高、操作简便等优点，是细胞培养过程中常用的细胞消化方法。通过严格遵守实验步骤和注意事项，可以确保细胞消化的顺利进行和实验结果的可靠性。
