qPCR(实时荧光定量PCR)中的CT值,即Cycle Threshold,代表PCR扩增过程中荧光信号达到设定的荧光阈值时所对应的扩增循环数。
CT值定在15-35之间,主要是基于以下几个方面的考虑:
1. 指数扩增期的选择
在PCR扩增过程中,扩增曲线可以分成四个时期:基线期、指数期、线性期和平台期。CT值通常设定在指数扩增期,因为在这个时期,PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系,这使得定量分析成为可能。指数期通常发生在PCR反应的前几个循环之后,大约在循环数15-35之间。
2. 扩增效率与准确性
CT值与起始模板量的对数存在线性关系。起始模板量浓度越高,CT值越小;起始模板量浓度越低,CT值越大。在15-35的CT值范围内,扩增效率通常较高,且误差相对较小。如果CT值过小(小于15),可能意味着扩增在基线期范围内,荧光信号尚未达到稳定状态,导致定量不准确。而如果CT值过大(大于35),则可能意味着模板起始拷贝数过低,扩增效率不佳或存在非特异性扩增,同样会影响定量的准确性。
3. 仪器检测灵敏度与稳定性
实时荧光定量PCR仪器通常具有较高的检测灵敏度,能够在较低的荧光信号水平下准确读取数据。然而,过低的荧光信号可能受到背景噪声的干扰,导致数据不稳定。因此,设定一个合理的CT值范围(如15-35)有助于确保数据的稳定性和可靠性。
4. 实验操作的可重复性
在PCR实验中,操作的可重复性对于结果的准确性至关重要。CT值在15-35之间时,由于处于指数扩增期,微小误差尚未放大,因此CT值的重现性极好。这意味着同一模板在不同时间扩增或同一时间不同管内扩增得到的CT值是恒定的,有助于确保实验结果的可靠性和可重复性。
综上所述,qPCR的CT值定在15-35之间主要是基于指数扩增期的选择、扩增效率与准确性、仪器检测灵敏度与稳定性以及实验操作的可重复性等方面的考虑。这一范围有助于确保定量分析的准确性和可靠性。