实验步骤

1. 蛋白提取

1) 取对数生长期的细胞，制备细胞悬液。

2) 加入1mL PBS，500g离心5分钟。

3) 吸干残留的PBS，估计样品体积，加入5倍体积裂解液，混匀。

4) 冰浴中以最大功率超声破碎细胞(3×10s)。

5) 4℃,12000rpm离心15分钟，收集上清。

6) BCA蛋白定量法测定蛋白浓度，蛋白上样Buffer将蛋白定量为5mg/mL，-20℃保存备用。避免反复冻融。

 

2. 蛋白浓度测定

1) 梯度稀释牛血清白蛋白（BSA）标准品

2) 制备BCA工作液

3) 将各个稀释浓度的蛋白质标准品和待测蛋白质样品加入到微孔板或试管中，分别加入BCA工作液，混匀。

4) 密封后，37℃保温30-60分钟

5) 冷却到室温，以空白为对照，测量样品在 562nm或该波长附近的吸光值

6) 将各个标准品和待测蛋白质样品在 562nm 处的吸光值减去空白标准品在 562nm 处的平均吸光值。

 

3. SDS-PAGE电泳

1) 制备SDS-PAGE 凝胶

A. 将灌胶玻璃板洗净，晾干固定，确定灌制分离胶液面标志线（距样品梳子底部约0.5-1.0cm 处）；

B. 配制10%分离胶8mL（见下表），快速灌入凝胶玻璃槽中，使其液面至标志线位置（避免产生气泡）；

C. 立即用去离子水覆盖胶面（隔绝空气，有助于凝胶聚合），室温放置约40分钟至分离胶凝固；

D. 配制5%浓缩胶4mL（见下表）。

E. 倒掉去离子水覆盖液，并用吸水纸吸掉残留的液体；

F. 将凝胶板重新垂直放置，轻轻加入5%浓缩胶液（注意避免产生气泡），插入样品梳，室温凝胶约40 分钟。

G. 轻轻拔去梳子，将玻璃夹板“凹”面贴紧电泳槽，两侧用夹子很好的固定在电泳槽上。

2) 电泳

A. 由-80℃冰箱取出提取的组织总蛋白样品，立即插入冰中（减少蛋白降解）待其融化；

B. 根据蛋白定量结果，加入相应体积的总蛋白样品与5×蛋白质凝胶电泳上样缓冲液混合，95℃变性10分钟，立即插入冰中待用；

C. 将样品轻轻加至凝胶孔中，电泳仪设置成稳压状态，接通电源，将电压调至80V 使样品通过浓缩胶与分离胶（电压约8v/cm）；

D. 电泳使染料至分离胶适当位置，结束电泳；

E. 凝胶电泳结束后，将凝胶上分离到的蛋白条带通过转移电泳方式转印至PVDF膜。

 

4. Western Blot

1) 转膜

A. PVDF膜先置于100%甲醇中浸泡2-3分钟，水、电转液依次漂洗2分钟×2次，置于电转液中备用；

B. 剪裁与胶同样大小的6 层滤纸，用转移缓冲液浸泡后待用；

C. 取下电泳板，将其平置（使“凹”面玻璃板在下），小心取出夹板中的垫片及去掉上层玻璃板，切除多余凝胶，将含样品胶用电转液漂洗一次；

D. 将样品胶与膜装入标有正、负极的转膜夹板中（由阴极侧开始，依次为海绵垫片→3 层滤纸→样品胶→PVDF膜→三层滤纸→海绵垫片），扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中；

E. 正确连接转移电泳连线，保证电荷由负极向正极流动。接通电源，恒压状态下，65V转膜2h。

F. 将转好的膜（参考目的条带分子量大小）对照marker进行裁剪。

2) 抗体孵育

A. 封闭：小心取出转移膜置于封闭液中，室温、摇床上缓慢摇动状态下封闭1h。

B. 一抗反应：将一抗用封闭液稀释；将封闭后的膜分别加入对应的一抗工作液中，4℃反应过夜。

C. 洗膜：将反应膜放入平皿中，用1× TBST洗涤三次，（室温下缓慢摇动洗涤）每次10分钟，洗净未结合的一抗。

D. 二抗反应：将二抗用1×TBST 稀释300倍；将洗涤后的一抗反应膜放入二抗工作液中（室温、避光缓慢摇动）作用60分钟。

E. 洗膜：用1×TBST洗膜，洗去游离二抗。

 

5. 显色及成像

1) 按1：1（v/v）混合ECL试剂盒中两种液体。

2) 将上述混合液均匀铺在PVDF膜表面，室温作用4分钟。抖掉膜上液体，将其放入化学发光成像系统成像。

下图；跑出来的其中的结果