1.制备培养滤液
摇好的培养液，细胞筛过滤去菌丝球，离心去细小菌丝 ，0.22uM过滤去细小颗粒。
2.超滤浓缩、更换buffer
1）新买的超滤管使用Milli-Q 水（过滤灭菌，水中看不见的细菌及其它物质）进行预清洗。定角转子，使超滤内管的膜面朝上，膜与轴垂直。加入蛋白液前，超滤管需要插在冰上预冷。
2）脱盐或更换缓冲液是从含有生物分子的溶液中去除盐分或溶剂的重要方法。盐分去除或缓冲液的更换可通过超滤管来完成。
上超滤柱之后4度离心，离心时间很长，协调好离心机。4度，5000g，每半小时查看离心状况。浓缩至1 ml轻轻加入新的Buffer（经0.22um超滤膜过滤），再浓缩至1ml。该过程可反复进行，直到杂质的浓度被充分降低。3-5次后基本更换buffer成功。一般不多于500ul，也有浓缩至200ul以内的情况。
3）取出最终蛋白浓缩液的操作在冰上操作，用黄枪头（200ul）取，顺着边缘插入枪头，轻轻吹打、混匀蛋白液，注意不要碰到超滤膜，然后吸取浓缩液，每次吸接近200ul，直到吸完。
洗脱使用20 mM pH7.4 PBS
(参考-140m MNaCl, 2.7mM KCl,20mM Na2HPO4,1.8mM KH2PO4, pH7.4)
Dissolve the following in 800ml distilled H2O.
NaCl 8g 137 mM NaCl
KCl 0.2g 2.7 mM KCl
Na2HPO4 1.42g 10 mM Na2HPO4 Na2HPO4.12H2O 3.58g
KH2PO4 0.24g 2mM KH2PO4
Adjust pH to 7.4 with HCl.
Adjust volume to 1L with additional distilled H2O.Sterilize by autoclaving.
People call this PBS 10mM, because the important component for buffer is Na2HPO4
4）处理超滤管，重复利用超滤管
倒出超滤管里的水，用milliQ水轻轻润洗几次，若管底有可见的蛋白沉淀，先加入水，然后用枪头轻轻吹打，然后倒掉。然后加入0.2M的NaOH溶液，室温放置20min，用MilliQ水洗干净，放4度保存，直到下次使用。一般来说，每根管用三四年不会坏。
5）问题
1.超滤管连水都离不下来怎么办
超滤膜中含有微量甘油，用0.1 N NaOH清洗，缓冲液或Milli-Q水再次清洗后甩干。清洗后的滤膜应立即使用，如暂时不用,请保持润湿状态,避免重新干燥。
2.浓缩后发现浓缩液中没有蛋白
超滤管起始蛋白浓度为25ug/ml，确保样品起始浓度大于这个浓度；是否选用了合适截留分子量的超滤管（目的蛋白分子量的1/2或者1/3）；使用的离心力是否合适
3.蛋白在浓缩时出现沉淀如何解决
蛋白浓缩过快或者过度浓缩（不超过20mg/ml）都有可能引起蛋白沉淀。
离心力降为推荐离心力的30%-50%；改用截留分子量大的超滤管(如原本选用10k,此时可以选择30k)；在浓缩过程中取出超滤管, 用枪头反复吹吸几次后再继续浓缩
注：超滤管采用热封设计，不能高温高压灭菌
3. 考马斯亮蓝法进行蛋白定量
考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度（Bradford Protein Assay Kit）
1.实验原理
考马斯亮兰 G-250 染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置由 465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。
染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在一定蛋白质浓度范围内(1～ 1 000 μ g) , 蛋白质与考马斯亮蓝G - 250 结合物在 595 nm 波长下的吸光度与蛋白质含量成正比 ( 符合郎贝比尔定律) ,故可以用于蛋白质含量测定。
蛋白质和染料结合的过程很快，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。
2.实验仪器和试剂
考马斯亮蓝染液-(CBB Staining Solution)
牛血清白蛋白(BSA)标准溶液 (BSA Standard Solution) (1 mg/ml)
分光光度计、试管（10mL）、移液枪、及试管架
3.实验步骤
以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。
根据测定结果，建立标准方程，计算相关系数R，相关系数一般大于0.9。以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，使用 Excel作图：（输入数据，插入XY散点图，添加趋势线，显示方程及R2）
样本测定：将待测样本用PBS溶液稀释至适当浓度，使其测定值在标准曲线的直线范围内（0～100µg，最好在40～80µg）。测定595nm 处吸光值，利用标准曲线求出相当于标准蛋白质的量（µg），从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/mL）。一般被测样品的A595nm值在0.1—0.5之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以减少取样量，如果仍然很大，可以定量稀释后再进行测定。
4.注意事项：
1）蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合的反应十分迅速，在2min左右反应达到平衡；其结合物在室温下1h内基本稳定。如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5－20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。
2）测定中，蛋白－染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
1．Bradford法由于染色方法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。
2．有些阳离子，如K+ 、Na+ 、Mg2+ 、(NH4)2SO4、乙醇等物质不干扰测定，但大量的去污剂如TritonX-100、SDS等严重干扰测定。
3．测定时仅使用一套比色杯（2个），并从低浓度到高浓度依次测定。中间不要用蒸馏水润洗比色杯，仅用待测液润洗2～3次即可。 另外，还要注意，玻璃仪器要洗涤干净并保持干燥，避免温度变化；取量要准确；分光光度计十分灵敏，测定时要认真仔细。
4.相关知识
1）超滤-以压力为推动力的膜分离技术。在压力推动下，流经膜表面小于膜孔的溶剂及小分子溶质透过膜成为净化液，比膜孔大的溶质及溶质集团被截留，成为浓缩液。
超滤管的功能-分离蛋白和蛋白浓缩
超滤离心管具有快速超滤功能，能够达到较高的浓缩倍数，实现从稀释和复杂的混合样本中浓缩回收目的产物。
分离蛋白: 用超滤的方法分离两种蛋白，这两个蛋白的分子量要相差 一个数量级(10倍)。
蛋白浓缩：截留蛋白是目的蛋白分子量的的1/2-1/3; 比如目的蛋白分子量为35kDa，就可以选择10kDa截留分子量的超滤管。若目的蛋白分子量为10kD左右，则可以用截留分子量3k的超滤管。
截留分子量 (Molecular Weight Cut Off, MWCO) 是指超滤膜在规定条件下对某一已知分子量物质的截留率达到90%时该物质的分子量。
20种氨基酸的平均分子量为138,小分子氨基酸出现的频率较大因此加权平均分子量为128，在此基础上减去一分子被脱去的水分子量，即128-18=110。所以“氨基酸残基”的平均分子量通常按110计算
2）为什么要纯化蛋白
蛋白质纯化在生物学领域具有重要的研究价值。通过感兴趣的纯化蛋白，研究人员可以分析其结构，观察酶活性，研究基因问题以及特定细菌抗体中开发抗生素等。
蛋白质是两性电解质，分子中的可解离集团主要是侧链集团，也包括末端氨基和羧基。多数蛋白等电点为中性偏酸，约5左右。蛋白质在等电点时净电荷为零，没有同种电荷的排斥，所以不稳定，溶解度最小，容易聚集沉淀。各种蛋白的等电点不同，在电场中移动的方向和速度也不同，所以可用电泳来分离提纯蛋白质。pH值小于等电点时蛋白质的总电荷是正的，大于等电点时是负的。
在不影响目标蛋白活性的前提下，确定纯化方法及PH缓冲液。
蛋白质的稳定取决于所使用的多组分缓冲体系，最佳条件是既可以溶解蛋白质，又可以保持生物活性。大部分蛋白质纯化是在体外进行，重组蛋白对应的缓冲系统都在模拟天然蛋白在体内的条件以期达到蛋白稳定保存和运输的目的。缓冲液的选择非常重要，合适缓冲液才能保证蛋白的活性和结构稳定。设计一个防止蛋白降解和聚合的蛋白纯化缓冲体系就非常重要。主要考虑以下因素（内容源于小木虫）：
1. pH值
很多实验的pH值设定在 7.4以模仿生物条件。如过你的目的蛋白在这个pH值下是稳定的，那就非常好了。如果不是，就需要改变pH值找到目的蛋白在溶液中处于可溶性且不会降解的状态。一个经验法则-蛋白在等电点附近的ph溶液中不易溶解，因为蛋白在其等电点溶液中表面没有净电荷，从而容易聚集。推荐用Expasy的ProtParam工具快速简便地计算蛋白等电点pI值，只要提交蛋白序列即可。
2.缓冲液成分
不与蛋白发生相互作用。如一些酶被磷酸盐缓冲液的磷酸盐基团抑制，会导致蛋白的功能缺失，反应前应彻底地透析掉。。典型缓冲液浓度范围20至100mM。
此外，一些缓冲体系对温度非常敏感，例如Tris-HCl缓冲液，如果你在25℃时将缓冲体系调至pH值8，pH值将在5℃时增加到8.58而在37℃时降到7.71。所以，如果打算在4℃条件下保存蛋白或在37℃进行实验，就应该考虑到室温下调的pH值可能在实验条件中就不适用了。
3. 盐
用150 mM的NaCl，以帮助保持蛋白的可溶性和模拟生理条件。
4. 还原剂
如果蛋白质含有半胱氨酸残基，半胱氨酸残基间的氧化可能导致蛋白聚集。因此往往会在缓冲液中添加一些还原剂，如DTT，TCEP或者巯基乙醇。TCEP是这三个还原剂中最稳定的，但它也是最昂贵的。我通常在纯化过程的缓冲液中添加DTT，在最后保存酶液的缓冲液中添加TCEP。一般比较合理的还原剂浓度是5~10mM。要确保还原剂浓度要远远高于你的蛋白浓度。因为DTT和巯基乙醇在室温下就会降解，所以需要将添加了还原剂的缓冲液处于低温保藏，或者在使用时再添加还原剂。
5. 稳定剂
通过添加一些稳定剂，以帮助提高蛋白纯化时的溶解度和稳定性。在缓冲液中添加惰性蛋白BSA某种程度可以稳定蛋白，但必须确保这些加入的稳定蛋白不干扰实验。有时添加甘油、聚乙二醇等添加剂可以增加缓冲液粘度，有助于防止蛋白聚集。另外，使用少量的表面活性剂和一些离子化合物如硫酸盐、氨基酸、柠檬酸等可以屏蔽蛋白间的离子相互作用，帮助蛋白溶解。
通过调整蛋白纯化缓冲液的pH、缓冲体系、盐离子、还原剂和稳定剂，可以建立一个完善的蛋白纯化缓冲体系，可以保持蛋白在纯化过程中的活性和稳定性！这一生产调整非常有利于蛋白产品、酶制剂产品以及抗体药物产品分离纯化后处理的生产工艺开发！
3）离心机是利用离心力将悬浮液中的固体颗粒与液体分开的设备，它可将乳浊液中两种密度不同又互不相溶的液体分开（例如从牛奶中分离出奶油），也可用于排除湿固体中的液体，亦或者利用不同密度或粒度的固体颗粒在液体中沉降速度不同的特点对固体颗粒按密度或粒度进行分离比较等。
离心机-利用沉降的原理，由于物体的惯性，在向心力的加速度使更致密的物质，在管的底部沿着径向方向分离出来。根据加速度值将离心机分为台式（最大15000 g），高速冷冻离心机（50000 g）和超速离心机（500000 g）。
离心机具有三个基本部件，即转子，驱动轴和电动机。转子通常由坚固的材料制成，例如铝合金或不锈钢。超过每分钟50000rpm的超高速离心机则最好选用钛合金了。钛合金具有密度小，比强度和比断裂韧性高，抗裂纹扩展能力好，低温韧性良好，抗蚀性能优异特性，但是其价格成本也比较高。
主要有两种类型的转子可用：
固定角度的转子：离心管与转子的转轴之间有一定的角度，角度范围通常在14°-45°之间。将样品管放置在金属转子上的加工孔中，该孔相对于垂直旋转轴成固定角度（通常为45°）。在离心过程中，该角度保持恒定，并且沉淀物靠在管的侧壁上。
摆桶式转子（水平转子）：将样品管放在从转子上悬挂下来的支架中。当施加向心力时，固定器向外摆动，使其与转子的水平轴成水平，并且在管的底部获得了颗粒。
