一、细菌培养
1.从检测培养基上挑取单菌落，连续划线接种，培养14-18h.
2、同时接种标准株H9812,划种于LB平板．36℃±1℃培养14-18h．
二、制备菌悬液
1.标号（比浊管）
2.在每个比浊管中加入1. 5ml CSB.准备一个空管加入备用CSB
3.用CSB湿润棉签，从培养基上到取适量细菌，光在管壁研磨，使菌均习愚浊于CSB中。(也可以用一次性接种环取菌在管壁上研磨）
4.比浊 G- 3.8-4.4 G+5.0-7.5→溶菌酶裂解
三、制备样品小胶块
1.标号，固定模具，拧紧螺丝
2.G-:400m菌悬液＋20m蛋白酶k(20mg/ml)（－20℃保存）混匀于1.5ml ep管 G+:取溶菌酶烈解后的菌悬液。
3.制备1%Seakem Gold:1%SDS琼脂糖．以25ml体系为例：23. 5ml TE＋0. 25gSKG，灌胶前加入 1. 25mlSDS。（加热溶解至澄清．56℃水浴中保温（一直放置其中） ）
4.在ep管中加入400m胶（已加SDS),用枪头轻轻吹打混匀，避免气泡产生。将混合物加入模具相应加样扎中，速度适中，避免气泡产生．4℃冰箱凝固5min
四、蛋白酶k消化
1.在50ml 聚丙烯螺帽管上标号．
2.制备细胞裂解液（CLB)/蛋白酶K混合液：每5mCLB加入25m蛋白酶k(20mg/ml)颠倒混匀→每管加入5ml CLB/蛋白酶K混合液．
3.将凝胶块移入相应管中，用刀片削去模具表面多余部分，用6mm宽小铲将胶块移入相应管中．使胶块浸在液面下。
4.将螺帽管放在54℃水浴探床孵育2h，转速150-170rpm,摇床中的水浴液面要高于试管内CLB液面。
5.切下的胶、模具、胶带、小铲70%异丙醇／含氨消毒剂（泡腾片）消毒
6.将灭菌纯水（试剂专级1级（18. 25MΩ·cm)]与TE缓冲液放在50℃水浴预热.
五、洗胶块
1.从水浴摇床中拿出螺帽管，轻轻倒掉CLB,将胶块置于绿色滤帽中（正中位置）按顺序摞好拧紧后放于白色长管中，加入50℃预热的灭菌绝水使其没过绿色滤帽．放于50℃水浴摇床中，摇10min.
2.倒掉水，用超纯水再洗一次．
3.倒掉水，加入50℃预热的TE缓冲液，放于50℃摇床摇20 min.
4.倒掉TE,用TE再洗3次，每次20min.
5.倒掉最后一次的TE,加入4mlTE→5ml管，继续下一步的酶切或4℃冰箱保存．
六、酶切
1.清理消毒桌面，准备好空白平皿，刀片，小铲在1. 5m印管上标号：标好H9812标准株
2.酶切前孵育：以灭菌超纯水制备酶切缓冲液，方法按说明书．(ΔH9812用xbal酶切,酶切缓冲液和醉切液配制方法固定)
3.在每个1. 5m印管中加入200微升酶切缓冲液
4.小心用小铲从TE中取出胶块，放在干净平皿上．
5.用刀片切下2mm宽的胶块，放入含酶切缓冲液的1. 5mlep管中，确保胶块在液面下，将剩余的胶块故回原来的TE中，用类似方法处理标准株H9812胶块
6.将ep管放在37℃(°根据酶的种类确定酶切温度）金属浴10min.
7.配制酶切液（酶要置于冰上，随用随取），混匀．
8.用枪头吸出酶切缓冲液，避免损伤胶块．
9.每管加入200m酶切液，金属浴至少2h
七、灌制电泳胶
1、将水浴温度调至56℃
2、配制0. 5xTBE (如 200ml 5xTBE+1800ml超纯水→2000ml 0. 5xTBE) 1%Seakem Gold(SKG)胶（如1g SKG胺＋100ml 0. 5xTBE→1% SKG胶100ml)(熔化时，微波炉加热10-205,混合：每隔10s重夏一次，直至胶完全熔化．放在56℃水溶备用)
3.将胶块直接粘在梳子齿上：
（1)调整梳子高度，使梳子齿与胶槽底面相接触，用水平仪调平
（2）从金属浴中取出胶块，平衡至室温。
（3)用枪头吸出酶切液，每管加200微0. 5xTBE,室温平衡5min.
（4)把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上，把标准菌株H9812加在第1. 5. 10个齿上（10齿梳子）或第1. 5. 10. 15个齿上（15步梳子）．
（5)用枪头小心吸去胶块边缘多余液体，室温风干一会儿，将胶调至平整。
（6)把梳子放入胶槽，确保所有胶块在一条线上，并且胶块与胶槽的底面相接触，从胶槽下部边角处缓慢倒入熔化的在56℃平衡的1%SKG,避免气泡产生，室温凝固20-30min.
（7)记录加样顺序
八、电泳
1.确保电泳槽是水平的，若不水平，调整槽底部旋钮，不要触碰电极
2.加入2L新配制的0. 5xTBE.关上盖子．
3.打开主机和的开关，泵设在70(这时缓冲液的流速约1L/min)和缓冲液在管道中正常循环。
4.打开冷凝机，确保预设温度在14℃(缓冲液达到该温度通常需20min左右）．
5.打开胶槽旋钮，取出凝固好的胶（连带黑板），用吸水纸清除胶四周和底面多余的胶．把胶小心放入电泳槽，关上盖子。
6.设置电泳参数，不同菌的电泳参数不同，记录电泳初始电流（通常120-145mA)
九、染色脱色
1.制备染色液，如需刺备600ml染液，则休系为540ml 超纯水＋60 ml I1M Nacl＋180微升Gelred（（制备后可用）2－3次））
2、电泳结束，关闭仪器，关闭顺序：冷凝机一泵一主机，放掉电泳槽中的TBE.用2L超纯水清洗电泳槽，并倒掉液体，打开泵，用超纯水冲洗管道10min，放水。［清洗：接软管放出电泳液→拔掉左侧软管→打开泵，循环一会儿→放出剩余液体拔掉软管→倒入超纯水2L→接上左侧软管，打开泵，循环10min→接软管放空超纯水→用纸擦干→碰融电极时小心］
3.取出胶，放在盛有染色液的避光托盘内，染色20-30min,(置子水平摇床上）
4.以500ml 超纯水脱色15~20min(置于水平摇床上）
5.用凝胶成像仪拍摄图像
注意事项：
（1)不要戴碰触过凝胶的手套触摸电脑鼠标、键盘，仓门和灯箱电源开头，防止污染。
（2)开机顺序：电脑－成像仪一软件
（3)使用过程中禁止开门，防止紫外线外漏．
（4)实验结束后，务必将内部的凝胶取出，将遗留在观测板上的水或其他液体擦干（使用软质纸）
（5)关机顺序：软件一成像仪一电脑。
十、读胶成像并保存
若凝胶成像时有虚影，可能为样本降解所致，可尝试在电泳时将760m硫脲（10mg/ml)加入至2L 0. 5xTBE 电泳液中（制冷阶段加入），注意硫脲有污染性！
