成像流式细胞术

成像流式细胞术（ImFC）代表了细胞测量领域的一项重大技术进步，它将流式分析的高通量能力与显微镜的详细成像特性有效地结合起来。

这种技术的发展源于将流式细胞仪的液流系统与先进的相机技术相结合，使得细胞群体的形态分析能够在高通量规模上进行，从而有效地扩展了细胞测量的领域。

成像流式细胞仪

Amnis® FlowSight®和Amnis® ImageStream®X Mark II（Cytek），均能捕获每个细胞的12幅图像，其中10幅可以是荧光图像。

ImageStream®X Mark II在分辨率、放大倍数和激光选项方面更为强大，提供了高达60倍的放大倍数和七种激光选项，而FlowSight®则提供20倍放大倍数和四种激光选项。

BD FACSDiscover™ S8兼具3种荧光图像、光谱分析和分选能力，在速度上比常规流式慢，但比Amnis®要快更多。

实验设置

Amnis®仪器的抗体方案设计指南与传统流式细胞术分析相似。应选择适合生物学问题的抗体方案，并在选择荧光团时考虑分子的表达水平，同时避免过度补偿。

Amnis®仪器上的软件（INSPIRE）和分析软件（IDEAS）都能有效地进行补偿。

数据采集

INSPIRE软件可以调整每个激光器的功率，这会影响信号水平。

进行滴定实验时，应在同一激光功率下测试同一方案里的抗体，以防止亮染色与暗染色结合时的饱和。

由于采集时间长且机器缺乏温度控制，建议固定细胞。

数据分析

数据分析通常使用IDEAS软件进行，这是Amnis® 提供的免费个人电脑软件。

FCS Express可以作为替代分析程序。IDEAS软件结合了流式细胞仪和显微镜软件中常用的工具，包括点图、直方图、统计表、图像库优化展示等。

分析新实验可能非常耗时，但一旦优化完成，可以快速应用于未来实验。

应用案例

                                      Amnis® ImageStream在免疫细胞中的应用：

1）自噬测定（图A-B）：

在人外周血单个核细胞（PBMCs）中进行的自噬测定展示了（A）CD8+ PBMCs中的LC3斑点。（B）通过未处理细胞（对照组）、用自噬诱导剂（雷帕霉素）或抑制剂（氯喹）处理的细胞中LC3和LysoID的共定位来显示自溶酶体的形成，进一步量化为具有亮度细节相似性（BDS）>1.5或>2的细胞百分比。BDS是IDEAS软件中的一个功能，它比较两张图像的亮度细节来量化共定位。

2）免疫突触检测（图C）：

在体外培养的小鼠CD90+ T细胞和CD11b+树突状细胞（DCs）之间检测免疫突触。使用抗小鼠肌动蛋白（phalloidin）-FITC抗体来检测突触形成。

3）吞噬作用测定（图D）：

在人CD14+巨噬细胞中测定FITC偶联微球的吞噬作用。

4）中性粒细胞分化（图E）：

小鼠骨髓Ly6G+中性粒细胞的分化。细胞用Fixable live dead violet marker (L/D)、抗小鼠Ly6G FITC抗体和DRAQ5核染色剂染色。DRAQ5染色显示的核形态表明了中性粒细胞的成熟状态。

总结：Amnis® ImageStream技术在免疫细胞研究中展现了其独特的能力，特别是在自噬、免疫突触检测、吞噬作用和中性粒细胞分化等复杂细胞过程的可视化和量化分析中。通过结合流式细胞术的速度和灵敏度以及显微成像的细节，该技术为免疫细胞研究提供了一个强大的平台。

总结

Amnis®技术是一个强大的工具，允许成像和流式细胞术的结合。然而，运行缓慢和复杂的长时间分析是选择这种技术而不是传统流式细胞术时需要考虑的因素。