一、原理

在免疫组织化学（IHC）信号定量中的核心思想是应用图像处理技术从原始图像中准确扣除细胞核信号（通常显示为蓝紫色），留下DAB显色信号（一般为红棕色）。随后，转换为灰度图像以获取光密度值而非灰度值。

在图像处理中，灰度值代表像素的明暗程度，数值越高表示像素越白，数值越低表示像素越黑。而光密度值（optical density, OD）则表示像素颜色的深浅程度，数值越大表示颜色越浓重。需要注意的是，灰度值与光密度值呈现负相关关系。

为了进行IHC信号的准确定量分析，研究人员可使用一个名为IHC Toolbox的Image J插件。可以从Image J的官方网站下载该插件，并在下载后将其放置在Image J软件的安装路径中的Plugins文件夹下。安装完成后，在Image J的Plugins菜单中即可找到IHC Toolbox插件的应用。

 

二、步骤

1.打开IHC Toolbox：依次点击 Plugins – IHC Toolbox。
2.选择一小块阳性区域，并在IHC Toolbox中点击Training。
3.细致调整Color Chooser，确保Color Filter中的阳性区域适合。
4.将Color Filter窗口转换为灰度图像：点击 Image – Type – 8-bit。
5.将灰度信号值转换为光密度值（OD）：点击Analyze – Calibrate。在Calibrate窗口的下拉框中选择Uncalibrated OD，然后点击OK。
6.调整阈值：点击Image – Adjust – Threshold。
7.手动调整阈值的上下限，以覆盖理想区域。
8.进行定量分析：点击Analyze – Measure。

 

三、教学

1.使用框选工具，在图像中选中一小块没有细胞核的阳性区域，然后点击“HC Tool Box”的“Training”选项，这将弹出“Color Chooser”窗口和“Colour Filter”窗口。

 

 

 

2.微调“Color Chooser”窗口的数值，以确保“Colour Filter”窗口显示的区域达到一个较为理想的状态。

 

 

3.将“Colour Filter”窗口转换为灰度图像：选择“Image”-“Type”-“8-bit”。

 

 

4.关键步骤是将灰度信号值转换为光密度值(OD)：在“Analyze”菜单下选择“Calibrate”，在“Calibrate”窗口的下拉框中选择“Uncalibrated OD”，建议勾选“Global calibration”。勾选后，此次使用ImageJ处理的所有图像的校准都将生效。

 

 

 

点击OK,弹出Calibration Function窗口,这就是灰度值和OD值的转换函数

 

 

5.调整阈值：选择“Image”-“Adjust”-“Threshold”。

 

 

6.手动调整阈值上下限，使之覆盖理想区域。由于经过HC Toolbox扣除了阴性区域，你也可以直接将下面的条子拖动到最右，然后点击一次左箭头，这样就覆盖了所有阳性区域。

请注意，不要点“Apply”，因为这将导致图像变成二值信号图，只有纯黑和纯白，你可以在此背景区域的信号值为0（255）0代表光密度值，255代表灰度值。这是纯白区域的特点。

 

 

7.定量:Analyze-Measure Results中

Area是阈值区域覆盖的面积

Mean是阈值区域平均OD值

Min是阈值区域最小OD值

Max是阈值区域最大OD值

IntDen是阈值区域总OD值

RawlntDen是阈值区域总灰度值

 

 

四、注意事项

1.IHC信号定量的首要步骤是去除细胞核染色。在这一步骤中，我们通常会使用IHC Toolbox插件来完成这一任务。然而，需要注意的是，该插件的分割功能在处理阳性区域和核叠加区域时存在一些争议。因此，在进行定量分析时，必须考虑到这些区域核染色可能会产生的影响。

2.由于IHC Toolbox与宏功能的兼容性较差，例如在Training阶段就无法使用Recorder记录数据，因此这套流程并不适用于批量处理过程。

3. 在流程的Calibrate环节中（第7步），进行校准非常关键。如果忽略这一步骤，分析得到的将是灰度值而非OD值。一些教程会建议将8位图像进行invert处理，而不进行校准。然而，这种处理方式会导致新图像的像素信号值为255减去原图像素信号值，与OD值的转换函数并不相同。

4.在设置测量参数时，确保正确配置输出结果。Min和Max参数有助于自我检查信号值的具体范围。灰度值通常在[0, 255]范围内变化，而OD值一般不会超过3。